中科院分子植物卓越中心蔡文娟博士：激光扫描共聚焦显微镜使用和管理心得分享

  细胞结构分析技术平台成立于2010年，经过10余年的发展，拥有多种细胞成像设备，包括激光扫描共聚焦（7台）、转盘共聚焦和SIM超高分辨等高端显微系统。本文4200字左右，适合反复研读学习。

  生命科学基础研究与人类健康和社会经济发展紧密关联，在科学和经济社会领域中的重要性日渐增强。Science 曾发布125 个挑战全球科学界的重要基础问题，其中涉及生命科学的问题约占 54%。生命科学研究过程离不开各类科学仪器的帮助，今年，仪器信息别策划话题：

  “生命科学技术平台经验分享”，邀请高校、科研院所公共技术平台的老师分享技术心得和经验，方便生命科学领域研究人员了解有关技术进展、学习仪器使用方法。 本篇为中国科学院分子植物科学卓越创新中心细胞结构分析技术平台主管蔡文娟撰写，蔡老师根据多年工作经验，详细的介绍了激光扫描共聚焦的发展、系统组成和应用，并分享了工作中仪器使用的心得体会。以下为供稿内容：1957年， Malwin Minsky博士在其博后阶段首次阐明了激光扫描共聚焦显微镜技术的基本工作原理，但由于当时只有少数强度的照明光源，工作一直停留在理论阶段。20世纪

  激光器技术的发展，激光扫描共聚焦技术开始逐步发展，直到80年代中期才基本成熟，有了成熟的商业化产品（Bio-Rad）。由于该系统所用光源为激光，成像方式为逐点扫描成像，因此又被称为“laser scanning confocal microscope”, 简称为LSCM。激光扫描共聚焦仪器发展至今，已不再是简单的光学显微镜 ，而是整合了光学显微镜 、激光、检测器、工作站和图像处理软件的复合型显微成像系统。1987年，White和Amos在英国《自然》杂志发表了“共聚焦显微镜时代的到来”一文，标志着LSCM已成为进行科学研究的重要工具。作为细胞生物学研究的必备工具，激光扫描共聚焦显微镜堪称各个成像平台的“扛把子”，其对各种标本和荧光标记方法具备很强的普适性，即使在各种高端显微成像技术快速的提升的当下，也依然占据着极高的使用率。

  中国科学院分子植物科学卓越创新中心所级中心细胞结构分析技术平台成立于2010年，经过10余年的发展，拥有多种细胞成像设备，包括激光扫描共聚焦（7台）、转盘共聚焦和SIM超高分辨等高端显微系统（），为中心内部及周边科研院所和公司可以提供专业的显微成像服务，最大限度地满足中心及周边的成像需求。

  一、 激光扫描共聚焦显微镜的组成和应用激光扫描共聚焦显微镜（以下简称为LSCM）的灵魂部件是针孔（pinhole），针孔与物镜的焦平面共轭，因此被称为“共（共轭）聚焦”。由于共轭针孔的存在，只有标本焦平面的荧光信号才会透过针孔被检测器捕捉，而非焦平面的信息被阻挡在针孔之外，形成类似光学CT的效果。配合针孔成像， LSCM硬件部分通常包括光学显微镜、激光器、扫描振镜、检测器和图像工作站组成，每一个重要部件均可根据实验需求选择正真适合的配置，以下将结合分子植物卓越中心细胞平台的实际的需求，逐一进行简要介绍。

  LSCM可以搭建在正置或倒置荧光显微镜上。生命科学研究中，倒置显微镜使用更广泛，适合组织切片、贴壁细胞等相对较薄的标本。样品固定在载玻片上，可以方便地倒置观察。在植物研究领域，倒置显微镜也经常用于观察拟南芥根/叶片、烟草叶片、原生质体等标本，这类标本的特点是相对较薄，制片简单，能够最终靠简单压片的方式，利用水或其他压片溶剂在载玻片盖玻片之间形成的吸附力，将标本固定住，从而能够倒置观察。但也存在部分没办法使用倒置观察的应用场景，如茎尖分生组织、较厚的作物叶片或根等，由于标本过于厚重，倒置观察时容易掉落，不方便固定，或者由于压片会导致表面形态发生明显的变化或组织破裂，进而影响定位观察。针对这类应用，正置显微镜就显得很重要，尤其是搭配合适的浸入式水镜，能够在一定程度上帮助这类厚标本实现清楚方便的显微成像。作为光学显微平台，需要考虑到研究所各个课题组之间的应用差异，保证正置与倒置的合理配备，设备组合可最大限度地满足各类研究需要。

  为了激发出足够的荧光信号，LSCM采取了激光作为照明光源。根据标记和成像需求，一般LSCM至少配置4个波段的激光器，包括405/488/561/633nm等，涵盖了整个可见光波段的激发需求，能满足大多数荧光染料和蛋白的成像。在此基础上，研究组经常涉及荧光共振能量转移（FRET）相关实验，需要对CFP和YFP等分子对进行特异性激发，这样的一种情况下，一定要选择配置有458和514nm激光器的LSCM系统。红色荧光蛋白中，mCherry以单体形式存在，不易出现由荧光蛋白多聚化带来的artifact定位现象，因此现在很多研究组选择mCherry荧光蛋白标记，543nm和561nm等波长都能够激发mCherry蛋白，但如果希望得到更为明亮和特异的红色荧光信号，最优选择含594nm激发波长的系统。除了固定波段的激光器，还可选择搭配脉冲式白色激光器，自由选择所需激发波段。由于白色激光器在激发波段方面调节的灵活性，以及其特有的脉冲式而非连续激发，能配合检测器做基于门控技术的荧光寿命成像，有助于过滤部分自发荧光信号，或者得到荧光寿命信息。分子植物卓越中心细胞平台（辰山园区）就配备了该系统，配合脉冲式白激光和高灵敏度检测器，能够直接进行FLIM-FRET实验，在荧光强度成像的基础上，增加荧光寿命维度的检测。

  扫描振镜一般由x和y两个方向的振镜组成，通过高速振动控制激光在成像视场内逐点扫描，“点动成线，线动成面”，形成一个完整的2D图片。根据振动速度的区别，在LSCM中大体上分为检流式振镜（galvanometer）和共振振镜（resonant）。检流式振镜是应用最多的扫描振镜，单个像素点上停滞时间在微秒层级，可激发出更多的荧光信号，保证图像信噪比。常规拍摄荧光2D/3D图像和非毫秒级变化的time-series，检流式振镜一般都能够完全满足需求。共振振镜的振动频率相比检流式有显著提高， 能实现万赫兹，512X512分辨率的图像采集频率可达到30fps。如果涉及到钙波捕捉、相分离小体快速融合/FRAP实验、囊泡运动等快速变化，使用该振镜更容易检测完整的运动变化。细胞平台2015年后购买的系统，多为混合式振镜（含有两种振镜），在实际实验中，会依据需求选择正真适合的振镜使用。但一定要注意的是，由于共振振镜速度很快，牺牲了每个像素点上的激发时间，图像的信噪比下降严重，一般需结合合适的图像处理，才能够获得相对清晰的共聚焦图片。近三年植物领域由于相分离和钙信号相关研究逐渐增多，对扫描成像速度的要求也日渐提高，共振振镜的存在可以很好地补充检流式振镜的不足，两种振镜同时存在，可兼顾成像分辨率和时间分辨率，更好地满足多种研究方向的需求。

  配合振镜的点扫描方式，光电倍增管（PMT）和雪崩式光电二极管（HyD）均可用于激光扫描共聚焦系统的荧光检测，实现光电子信号的倍增放大。除了常规的PMT（一般以多碱作为光阴极感光材料），细胞平台每套LSCM系统上也会配置高灵敏度的GaAsP检测器（镓砷磷为感光材料的PMT）或HyD检测器，目的是提高检测灵敏度，提升弱信号的捕捉能力。对于较明亮的荧光信号，常规PMT即可满足需求；碰到相对较弱的信号，建议使用高灵敏度的GaAsP或HyD检测器，以获得信噪比更高的图片。但实际使用中，高灵敏度检测器并非万能，如果荧光发射在近红区域（Cy5.5和Cy7等），常规PMT的检测效率会相对更高，是因为不同的感光材料对各个光谱波段的响应效率不一样。作为细胞成像平台，需要保证各类型检测器的存在，根据荧光染料的强度和特性，给出专业的建议和设置，可以更加好地保证成像效率。

  激光扫描共聚焦系统要整合多种硬件协同工作，因此对图像工作站和操作软件都提出了较高的要求。操作软件和工作站必须能稳定运行，精准控制各电动部件，流畅采集显微图片，针对3D/time series等较大的图像数据，能确保后期图像处理速度。一般来说，成熟的商业化共聚焦系统在硬件控制上都能做到稳定流畅，但对于后期的图像处理，则应该要依据平台常见的数据做合理配置。反卷积处理，3D重构和AI分析等图像数据处理都对图形处理显卡有一定的要求，因此我们平台大多数都会选择配备有GPU的工作站，以满足慢慢的升高的分析需求。同时，在实际使用中，尽可能的避免在采集电脑上使用USB等移动存储设备，以最大可能杜绝电脑病毒的存在引起整机系统故障。

  二、 激光扫描共聚焦系统管理心得和未来可提升空间细胞平台成像设备类型多样化，各有特点，作为其中的“扛把子”成员，激光扫描共聚焦系统使用频率极高，受众很广，应用方向也更为多样化。作为平台管理人员，如何管理统筹多台LSCM系统的使用，使其更好地服务于科研工作，也是常思常修的一门功课。现将日常管理心得和提升空间分享如下：

  1、激光扫描共聚焦系统的日常维护必不可少，尤其是物镜的清洁和光路的校准。每位用户根据观察标本的不同，会选择空气镜/水镜/油镜等不同介质类型的物镜，很容易存在交叉污染，导致物镜不正确使用。在培训用户遵守使用章程的同时，平台工作人员一定保证2-3天检查一次常用物镜的清洁程度。光路校准方面，建议根据仪器使用状况每半年或一年检查一次光路状态，保证光路的准直。如果共聚焦光路上搭载了超高分辨系统，使用中尤其必须要格外注意光路状态，以确保使用效率。

  2、激光扫描共聚焦系统的基础操作培训是重中之重。平台工作人员要精通已有设备的软件使用和参数调节，组织小范围培训，每次上机培训不超过5人，确保培训效果。培训必须结合考核进行，第一次上机实验须保证培训老师陪同，以了解用户的实验和使用薄弱点，巩固培训效果。

  3、预约体系和微信用户群的合理使用。目前中科院仪器平台有统一的预约体系，可以在网预约所需仪器机时。但作为使用频率极高的激光扫描共聚焦系统，经常面临僧多粥少难以预约的状况。我们针对高频使用的LSCM建立了仪器专用微信用户群，培训考核通过后即可入群。用户在使用结束或临时取消后会在微信群内公告，便于后续用户及有需求的用户及时知晓，提升使用效率。同时，该仪器如有任何不合理使用和故障，管理人员也可在群内及时公告，方便用户调整实验。

  4、拓宽平台设备的应用边界，提升管理人员的技术能力。作为平台管理人员，需要重视生命科学领域的研究进展，尽可能从应用角度提前布局所需的成像设备，做到有备无患，不断拓展应用边界。另外，必须要时刻关注显微成像的技术前沿，结合用户的实验特性和科研目的，立足已有的设备做必要的改造和改进，提升自身的技术能力。

  5、国产化成像设备的落地展望。2019年已有相关国产化LSCM设备搭建成功的报道（苏州医工所），2021年也有商业化SIM超高分辨显微镜的落地（北京大学），今年再传出国产超分辨显微成像设备商业交付的消息（中科院生物物理所），这表明国产化设备正在显微成像赛道不断发力，相信其能够更好地结合国内科研用户的应用需求，不断突破瓶颈，落地于细胞平台，提升平台的技术实力。

  蔡文娟 博士，高级工程师，中国科学院分子植物科学卓越创新中心（植物生理生态研究所）细胞结构分析技术平台主管。2012年中国科学院上海生科院植生所获博士学位，2012-2017年中科院上海生科院植生所担任助理研究员， 2017-2020在奥林巴斯中国有限公司担任应用工程师，2020年12月加入中科院分子植物科学卓越创新中心，担任细胞结构分析技术平台主管，主要负责所级中心细胞结构分析技术平台的管理维护和运行，承担院级功能开发研制项目，承担和参与多项国自然基金等。

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